1925年，周作人发表短文《伤逝》，其中引用了一首罗马诗人的诗，中有：“兄弟，只嘱咐你一声珍重！”之句。不久，鲁迅亦发表小说《伤逝》，开篇便说：“如果我能够，我要写下我的悔恨和悲哀，为子君，为自己。”晚年，周作人在《知堂回想录》中这样写道：“《伤逝》不是普通恋爱小说，乃是假借了男女的死亡来哀悼兄弟恩情的断绝的……我也痛惜这种断绝，可是有什么办法呢，人总只有人的力量。”
两周后，鲁迅又发表小说《弟兄》，这篇文章完全是按照1917年周作人出疹子，自己惊慌失措、细心照料一事，并且向周作人表达了“鹡鸰在原”（鹡鸰亦作脊令，是一种生活在水边的小鸟，当它困处高原时，就悲鸣向同伴求救，故诗经中云“脊令在原，兄弟急难”）的意思。
鲁迅收藏的现代作家的译著中，以周作人的译著种类为最多。二人反目后，鲁迅仍搜集周作人的作品。
鲁迅时常惦念周作人，他常对周建人说：“八道湾只有一个中国人了。”
《语丝》被张作霖查封后，鲁迅担心周作人的安危，给周建人、川岛等人写信说：“他之在北，自不如来南之安全，但我对于此事，殊不敢赞一辞，因我觉八道湾之天威莫测，正不下于张作霖，倘一搭嘴，也许罪戾反而极重，好在他自有他之好友，当能相助耳。”
李大钊遇害后，周作人将李的大儿子李葆华藏在八道湾，后送其去日本留学。鲁迅得知此事后，对周作人大加赞赏，鲁迅去世后，周建人在给周作人的信中提及此事。
一次，周作人的一部译稿交给商务印书馆出版，鲁迅去时，编辑正在校勘，鲁迅说：“启孟的译稿编辑还用得着校吗？”在商务印书馆工作的周作人说：“那总还是要看一遍的吧！”鲁迅这才默不作声了。
1933年，鲁迅再次向弟弟发出求和的讯号，他在其诗《题三义塔》中写道：“度尽劫波兄弟在，相逢一笑泯恩仇。”
鲁迅知道周作人的“日本情结”，在逝世前特地让周建人转告周作人：“遇到此等重大问题时，亦不可过于后退。”
鲁迅一次次示好并没有得到周作人的响应，一直到他去世，兄弟二人都未能和解。
与鲁迅断交后，周作人依旧平静地上课、作文。但他在1923年7月25日所写的《自己的园地·旧序》中，重复了7月18日写给鲁迅字条中的话：“过去的蔷薇色的梦都是虚幻。”
1924年6月，周作人写《破脚骨》一文，据川岛说，此文是针对鲁迅，在文中，周暗示鲁迅是个“无赖子”。
舒芜在《周作人对鲁迅的影射攻击》一文中说：“周作人在公开发表的文字中，对鲁迅的人身攻击却是时时处处，一触即发，常常是非常恶毒的。”
周作人对鲁迅和许广平的结合亦有微词，他说鲁迅好色、纳妾，晚年，他的日记中仍有“兄弟皆多妻”之语。
虽然失和，但兄弟二人却没有断了联系，他们都在《语丝》写文章，有共同的朋友，周建人、川岛不止一次充当了二人沟通的桥梁。二人还一致对外，在女师大驱赶校长杨荫榆的风潮中，周作人在鲁迅起草的《关于女师大风潮的宣言》上签了字；在鲁迅与陈源的比战中，周作人毫不犹豫站在了长兄一边。
荆有麟回忆，二人失和后，还常在北大教员休息室见面，一接触便起争执。可一旦有人攻击周作人，鲁迅便用给中笔名代弟弟应战。成仿吾和鲁迅论战时，周作人也在其文章中为鲁迅帮腔。“三·一八惨案”发生后，鲁迅被列入北洋政府的缉捕名单，周作人知道后，马上托人通知鲁迅。
周作人的《五十自寿诗》发表后，友人们纷纷唱和，引发一场风波。鲁迅却能理解二弟，他在给杨霁云的信中说：“周作人之诗，其实是还藏些对于现状的不平的，但太隐晦，已为一般读者所不憭……”
1936年10月19日清晨，鲁迅逝世。第二日，周作人恰好有一堂《六朝散文》课，他没有请假，而是挟着一本《颜氏家训》缓缓走进教室。在长达一个小时的时间里，周作人始终在讲颜之推的《兄弟》篇，只字未提其他事情。第一堂课下课前几分钟，周挥一挥袖子，掸了掸粉笔灰说：“对不起，下一堂课我不讲了，我要到鲁迅的老太太那里去。”这个时候，大家发现周的脸色非常难看。柳存仁回忆：“他并没有哭，也没有流泪，可是眼圈有点红热，脸上青白的一层面色，好像化上了一块硬铅似的。这一点钟的时间，真是一分钟一秒钟的慢慢的捱过，没有一个上课的人不是望着他的脸，安静地听讲的。这个时候容易叫你想起魏晋之间的阮籍丧母的故事。”
解放后，周作人写了《鲁迅的故家》、《鲁迅小说里的人物》等作品，在谈及鲁迅时，也会称“家兄”。陈迩冬回忆，他在周作人屋中见到过鲁迅拓的汉碑，一次，周送他出门时，指着外院的丁香树说：“这是家兄种的。”
1956年，到北京出席鲁迅逝世20周年纪念活动的曹聚仁到八道湾拜访了周作人。之后，曹在《与周启明先生书》中写道：“我们那天又谈到了鲁迅的作品，鲁迅自己推荐了《孔乙已》，因为那一篇小说写得从容不迫”，“我那天说到了自己的爱好，我是最喜欢《在酒楼上》的”，“你也同意我的说法，你说，这是最富鲁迅气氛的小说”。
1958年，周作人在给曹聚仁的信中，谈及上海鲁迅墓前的塑像说：“死后随人摆布，说是纪念其实有些实是戏弄，我从照片看见上海坟头所设塑像，那实在可以真是最大的侮弄，高坐在椅上的人岂非是头戴纸冠之形象乎？假使陈西滢辈画这样一张相，作为讽刺，也很适当了。”
1957年，周作人的女儿静子在西北大学简报发表《回忆我的伯父鲁迅先生》一文。1961年10月，周作人代静子写纪念鲁迅的文章（见张铁荣、张菊香合编《周作人年谱》）。有研究者认为，1957年周静子的《回忆我的伯父鲁迅先生》行文风格完全是周作人式的，周作人也将此文收入其《鲁迅的青年时代》一书中，因此认为，《回忆我的伯父鲁迅先生》也是周作人为静子捉刀，只是周的日记并未记载。
徐淦回忆，他在与周作人日常闲谈中常提到鲁迅，“知堂很很坦率，从他的口吻中，我听出他对杰出的兄长之爱和敬，始终如一，像两人儿时、少时、青壮年、中年时的莫逆有增无减”。羽太信子一次给徐送茶时，也提到鲁迅，周作人当时翻译信子的话说：“内人告诉足下，自从足下来后，院子里的左邻右舍，都对她说，她们觉得又像过去大先生住在这里的时候，看到通宵在灯下干夜活的情形了，她们对大先生都是很敬爱、挺怀念的。”
1966年7月2日，周作人开始阅读鲁迅的杂文。周氏兄弟在离世之际，都是阅读对方的文章。
周作人不仅与长兄鲁迅失和，与三弟周建人的关系亦不睦。
据周海婴记载，羽太信子怀孕后，其妹妹芳子从日本到绍兴照顾信子。信子得到芳子无微不至的照顾后，渐渐离不开芳子了。为了把芳子长久留在身边，她便准备撮合芳子和小叔周建人。
当时周建人青梅竹马的表妹因病去世，他十分悲痛。信子便乘机灌醉了周建人，将芳子推进周建人的房间。鲁迅谈及三弟的婚姻时，说是“逼迫加诈骗成局”。
周建人与芳子婚后，信子更加肆无忌惮地使唤二人。夜深了，她不让芳子回房照顾自己的孩子；她经常使唤周建人，动作稍慢就训斥：“慢得像虫爬！”“木乎乎，木手木脚的中国人！”
据俞芳记载，在绍兴时，周建人与芳子关系尚好。周家迁到北京后，芳子看到姐姐大肆挥霍，十分羡慕，对信子言听计从，效仿信子，贪图享乐，常埋怨丈夫无能，不会赚钱。一次，周作人夫妇、芳子带着孩子去游玩，周建人准备同往，没想到，他走到车子旁边时，芳子一脸不屑地说：“你也去吗？”周建人看着妻子冰冷的表情，十分难受。
周建人到上海后，希望妻子和孩子也一同到上海居住。但信子不让妹妹离开，芳子也不愿离开，反而经常写信向周建人要钱。后来，周建人积劳成疾，患了飞机和，芳子仍拒绝到上海照顾丈夫。五年后，心灰意冷的周建人与王蕴如结合。
鲁迅去世的1936年冬天，鲁老太甜八十寿辰，周建人、王蕴如到北京为母亲祝寿。结果，信子、芳子大闹寿宴，周建人与芳子的长子周丰二更是手持军刀从屋内冲出，要砍周建人，被亲友拦下。此后，周丰二打电话到日本领事馆，要求他们扣留周建人，将其“法办”。周、王二人无奈，只能提前回到上海。时候，鲁老太甜伤心地对俞芳说：“如果大先生还在，八道湾不敢如此嚣张……”
抗战爆发前，冯雪峰认为，要让周作人接触进步势力，他隐约表示让周建人去接近周作人。也有人对周建人说，生物学家秉志由上海一家（书局）供养着，周作人只要愿意来上海，生活完全不成问题，商务印书馆或其他书局可以供养。周建人想起鲁迅生前说过的周作人不如南来安全的话，于是致信周作人，恳请其来上海，但周作人未作复。
寿宴之后，周作人不再给八道湾寄钱，唯独通过母亲给大女儿马理（周鞠子）每月二十元。抗战时期，周作人通过日本使馆，要求商务印书馆直接将周建人的一半工资，汇给周作人。兄弟关系更加恶化。
解放后，羽太芳子向法院起诉，状告周建人“重婚”。一些老友发现芳子的诉状出自周作人之手（周作人说他改了几个字），叹道：“知堂老人坐不住，又出山了。”法院经过调查，判决周建人与芳子实际离婚城里，周丰二与周建人脱离父子关系。
刘哲民记载，解放后，郑振铎、茅盾、叶圣陶（周海婴记载为叶圣陶、胡愈之）三人试图为周作人、周建人兄弟调解。他们拉着周建人到八道湾做客，周作人很客气地招待了他们，但兄弟二人却互相不搭理对方。面对此僵局，三人不知该如何劝说，只好无功而返。
周作人回忆，全国解放后不久，他在教科书编审委员会碰到周作人，二人都不由自主地停下了脚步。二人都老了，周作人颇为凄凉地说：“你曾写信劝我到上海。”
“是的。我曾经这样希望过。”周建人回答。
“我豢养了他们，他们却这样对待我。”
周建人听了这话，觉得他还不明白，还以为自己是八道湾的主人，而不明白其实他早已是一名奴隶。
这次意外相遇，成为这对兄弟的永诀。
【疏离】
周作人在《鲁迅的故家》中这样写母亲：“她没有正式读过书，却能识字看书，早年只读弹词说部，六十以后移居北京，开始阅报，日备大小报两三份，看了之后与家人好谈时事，对于段张冯蒋诸人都有批评。”周还回忆：“她是闺秀出身，可是有老百姓的坚韧性。清末天足运动兴起，她就放了脚，本家中有不第文童，绰号‘金鱼’的顽固党扬言曰：‘某人放了大脚，要去嫁给外国鬼子了。’她听到这话，并不去找‘金鱼’评理，却只冷冷说道：‘可不是么，那倒真是很难说的呀。’她晚年在北京常把这话告诉家里人听，所以有些人知道，别的事情也有可以讲的，但这一件事就很足以代表她的战斗性……”
鲁老太太搬到阜成门西三条与鲁迅同住后，周作人常常逾期给母亲生活费，鲁老太太极为不满，有时坐车到八道湾去要账。鲁迅知道后，劝母亲不要去，免得淘气（受气），并说要钱我这里有。鲁老太太说：“并不是等钱用，而是气他们的这种行为。”接着又叹道：“只当我少生了他这个儿子。”
周作人称呼母亲为“鲁迅的母亲”、“鲁迅的老太太”或“鲁老太太”。鲁迅去世的第二日，周作人给学生讲了一节课后，说：“对不起，下一堂课我不讲了，我要到鲁迅的老太太那里去。”
1936年10月，北大召开悼念鲁迅大会，会上，周作人称呼母亲为“他（鲁迅）的母亲”，与会的老舍听到后极为反感。后来老舍在一次纪念鲁迅逝世的会议上提到周作人时说，这种人连自己的母亲都不肯承认，何况国家。
常风回忆，1938年夏，叶公超回北平接家眷，并受中央研究院和北大之托敦促陈垣和周作人南下。叶向周说明来以后，周表示：“在北平如果每月有二百元就可以维持生活了，不必南行了。”然后说举家南迁的种种困难，“鲁迅的母亲和他的女人都要靠我养活，老三一家也靠我养活。”常风“听到他提到自己的母亲时竟然说是‘鲁迅的母亲’很觉着惊愕，以后和他谈话谈到南行的话题时有两三次他谈到周老太太时也是说‘鲁迅的母亲’”。谈话结束后，常风仍耿耿于怀：“我一路走着想起周作人称他们弟兄三位的母亲为‘鲁迅的母亲’，好像是在说什么不相干的人的老太太，感到十分刺耳不解。”
晚年，周作人在《鲁迅的故家》中这样写道：“鲁老太太是鲁迅的母亲，她的母家姓鲁，住在会稽的安桥头，住民差不多全是姓鲁的。”之后，再提及母亲的地方，他一律称呼为“鲁老太太”。
俞芳在《谈谈周作人》中回忆：“太师母（鲁老太太）也常谈周作人的长处。她说，老二很爱整齐，他的抽屉，总是整理的整整齐齐的，他包的东西，棱角分明，捆扎细致。他的性格和顺，遇事很好商量，对人谦和……老大（鲁迅）进三味书屋读书时，是给他买了一张有两个抽屉的书桌的。当时在三味书屋读书的学生，都是用这种书桌的。而老二（周作人）进三味书屋时，因为家用紧，没有给他买书桌，只从家里搬去一张没有抽屉的方桌供他使用，他起初有些不高兴，认为不像样子，怕别人见笑，但一经和他说明家境困窘等道理，他就没有什么意见了。”“老大去南京读书时，太师母曾借贷凑了八元钱给他，而当老二去南京时，太师母连八元钱也难筹措了。老人家鼓励他说：‘穷出山，富……’（这句原话我记不完整了，意思时：穷人家的子弟读书刻苦，有成就；富家子弟贪图享受，读书不刻苦，学不好。）他能理解家里的难处，拿了点路费，就高高兴兴地上路了。”
俞芳回忆：“太师母有时也谈周作人的不足之处，她说老二从幼小时起，一直受到大家的照顾，养成了他的依赖性，事事要依赖家里人，特别是依赖老大。他对家庭没有责任感，在他心里，家里的事，都应该由老大负责，与他无关。”这大概也是周作人称呼母亲“鲁迅的老太太”的原因之一。
鲁迅南下后，周作人很少到西三条探望自己的母亲。有时母亲身体不适，就由羽太信子或羽太芳子去看望。他们仅给鲁老太太开些阿司匹林之类的药物服用。
1932年，鲁老太太大病一场，刚开始，周作人等人并未重视，后来病情日渐严重，才请医生出诊两次。母亲病重后，周作人忙给在上海的周建人写信，告知母亲生病。鲁老太太托人给鲁迅发去电报，鲁迅便赶回北平。而鲁迅一到，周作人便放手不管了。
俞芳回忆：“鲁迅逝世的电报到达八道湾后，周作人找宋紫佩同往西三条，通知太师母。事后，太师母对俞藻说，那天，老二和宋紫佩同来，我心�
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